绍兴府山阴县祝英台，女扮男装化名祝九郎赴杭城求学，在长亭途遇梁山伯，因言语投契，二人结为异姓兄弟。同窗三载，梁山伯不知祝英台为女身。

一日，学友姜不懒、梅不孙怀疑祝英台为女扮男装，设计试之，果然被二人看出破绽。祝英台难以继续求学，遂假造家中来信，辍学返里。梁山伯为之送别，祝英台一路见景题诗，以言语挑逗，梁山伯始终未能领悟。到达清溪渡口，需要尚水过河，祝英台恐暴露女身，将“好”字故意颠倒，令其去问先生，后留诗于沙滩，并许婚九妹，嘱其“一七、二八、三六、四九”来祝家行聘。

梁山伯如期赶至祝家，祝英台之父祝公远已将祝英台许配同邑马文才。梁山伯失望而归，吐血而亡。祝英台闻噩耗，即往梁山伯坟前祭奠，坟忽裂开，祝英台钻进坟墓，双双化为飞蝶。马文才闻讯，亦悬梁自尽。

马文才阴魂赴阴曹地府告状，阎王取金盆一只，命梁山伯、马文才二人分别与祝英台濯发，能结发者即为夫妇。结果，梁、祝结发，阎即判二人为夫妇，马文才不服，在阴曹大吵大闹，阎王罚其投胎为公猪，并赐梁山伯与祝英台当日还魂，二人生生世世永为夫妇。梁山伯书童四九与祝英台婢女银心，亦于同日成亲。

本剧渊源较早，宋元南戏即有《祝英台》。